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Artículo Original

Detección de bacterias periodontopáticas en niños con anemia de Fanconi

Karine Lyko1, Carmem Bonfimz2, Elaine Machado Benelli3, Cassius Carvalho Torres-Pereira4, José Miguel Amenábar4

Resumen

Objetivo: Comparar la prevalencia de cuatro bacterias periodontopáticas incluyendo Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum y Treponema denticola en muestras de placa supragingival de niños con y sin anemia de Fanconi.

Material y métodos: Muestras de placa supragingival fueron colectadas en 71 personas con edades entre 6-18 años de edad. Las muestras se dividieron en tres grupos: anemia de Fanconi pre-trasplante (n= 25), anemia de Fanconi post-trasplante (n=23) y control (n=24). Las bacterias se identifi on mediante la reacción en cadena de la polimerasa para amplifi in vitro al gen codifi 16S rRNA.

Resultados: El A. actinomycetemcomytans sólo fue encontrado en una muestra del grupo pretrasplante. El microorganismo P. gingivalis se identificó en una muestra del grupo pre-trasplante y en una del grupo post-trasplante. El T. denticola se encontró únicamente en dos muestras del grupo pre-trasplante. El microorganismo F. nucleatum se observó en todos los grupos. La presencia de los microorganismos varió del 30% en el grupo control al 58% en el grupo Prétrasplante. No fueron encontradas diferencias estadísticas entre los grupos.

Conclusión: Los resultados del estudio sugieren que las alteraciones sistémicas encontradas en los individuos con AF no afectan la prevalencia de las cuatro bacterias analizadas.

Palabras clave: Placa dental, Microbiota, Reacción en Cadena de la Polimerasa, Anemia de Fanconi.


Artigo Original

Detecção de bactérias periodontopatógenas em crianças com anemia de Fanconi

Resumo

Objetivo: Comparar a prevalência de quatro bactérias periodontopatógenas incluindo Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonasgingivalis, Fusobacterium nucleatum e Treponema denticola em amostras de biofilme supragengival de crianças com e sem anemia de Fanconi.

Materiais e métodos: Amostras de biofilme supragengival foram coletadas em 71 pessoas com idades entre 6-18 anos. As amostras se dividiram em três grupos: anemia de Fanconi pré-transplante (n= 25), anemia de Fanconi pós-transplante (n=23) e controle (n=24). As bactérias se identificaram por meio da reação em cadeia da polimerase para amplificar in vitro o gene codificante 16S rRNA.

Resultados: O A. actinomycetemcomytans foi encontrado unicamente em uma amostra do grupo pré-transplante. O microorganismo P. gingivalis foi identificado em uma amostra do grupo pré-transplante e uma do grupo póstransplante. O T. denticola foi observado em duas amostras do grupo pré-transplante. O microorganismo F. nucleatum foi observado em todos os grupos. A presença dos microorganismos variou de 30% no grupo controle a 58% no grupo pré-transplante. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos.

Conclusão: Os resultados do estudo sugerem que as alterações sistêmicas encontradas nos indivíduos com AF não afetam a prevalência das quatro bactérias analisadas.

Palavras chave: Placa dentária, Microbiota, Reação em Cadeia da Polimerase, Anemia de Fanconi.


Original article

Detection of periodontopathic bacteria in children with Fanconi anemia

Abstract

Objectives: compare the prevalence of four periodontopathic bacteria including Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum and Treponema denticola in saliva samples from children with and without Fanconi anemia.

Material and methods: Dental plaque samples were collected from 71 children and adolescents, aged 6-18 years old. The samples were divided in three groups: Fanconi anemia before transplant (n=25), Fanconi anemia after transplant (n=23) and control (n=24). The test bacteria were identified using a 16S rRNA-based PCR analysis.

Results: A. actinomycetemcomytans was found only in one sample of Fanconi anemia before transplant group. P. gingivalis was identified in one sample of Fanconi anemia before transplant group and Fanconi anemia after transplant group. T. denticola was found in two samples of Fanconi anemia before transplant group. F. nucleatum was observed in all groups. The presence of microorganisms ranged from 30% in the control group to 58% in the Fanconi anemia before transplant group. No statistical differences were found between groups.

Conclusion: Systemic alterations found in FA subjects did not affect the prevalence of the four bacteria analyzed.

Key words: Dental plaque, Microbiota, Polymerase Chain Reaction, Fanconi Anemia.


  1. Master en Odontología, Universidad Federal de Paraná, Brasil.

  2. Médico Responsable Centro de trasplante de médula ósea Hospital de Clínicas, Universidad Federal de Paraná, Brasil.

  3. Profesora asociada, Departamento Bioquímica, Universidad Federal de Paraná, Brasil.

  4. Profesor adjunto, Departamento Estomatología Universidad Federal de Paraná, Brasil.

Introducción

La anemia de Fanconi (AF) se caracteriza por insuficiencia de la médula ósea, anormalidades físicas y aumento del riesgo de malignidad. La insuficiencia de la médula ósea progresiva con pancitopenia típicamente comienza a los 7 años de edad, a menudo con trombocitopenia o leucopenia1.

El trasplante de células tronco hematopoyéticas es la única terapia curativa para las manifestaciones hematológicas de la AF. Idealmente, el trasplante se lleva a cabo antes de la aparición de síndrome mielodisplásico o de la leucemia y antes de que se den múltiples transfusiones de apoyo hematopoyético2.

Las condiciones orales asociadas con AF incluyen a las enfermedades periodontales3 y esta susceptibilidad está asociada con el grado y la duración de la granulocitopenia, la severidad de la condición dental preexistente, los cambios en la integridad de la mucosa, así como los cambios en las glándulas salivales y en la microbiota oral4. Por otro lado, el uso de quimioterapia, radioterapia, y agentes inmunosupresores antes del transplante también aumentan el riesgo de la enfermedad periodontal en estos individuos4-7.

La gingivitis y la periodontitis son un conjunto de enfermedades de naturaleza infecciosa e inflamatoria8. El factor etiológico primario de este tipo de enfermedades es la presencia de bacterias específicas organizadas en forma de placa dental. La microflora responsable de estas enfermedades es compleja, debido a que se han detectado más de 700 especies bacterianas diferentes en la placa dental. Algunas de las principales especies son: Agregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum y el Treponema denticola9-12.

Es de particular importancia investigar la colonización temprana de patógenos periodontales, por ser un enfoque importante para la prevención y el tratamiento de la enfermedad periodontal. Sin embargo, no hay ninguna información relacionada con la prevalencia de microorganismos patógenos periodontales en niños con AF antes y después del trasplante. Por estas razones, el objetivo de este estudio preliminar fue comparar la prevalencia de cuatro bacterias periodontopatógenas: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum y Treponema denticola en muestras de placa de niños con AF.

Material y métodos

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Hospital de Clínicas de la Universidad Federal de Paraná, Brasil. Los padres o tutores de los niños recibieron información detallada sobre la naturaleza y los procedimientos involucrados en el estudio y firmaron formularios de consentimiento informado.

Grupos de estudios

Los pacientes con AF fueron elegidos de entre los niños y adolescentes registrados en el Servicio de Trasplante de Médula Ósea del Hospital de Clínicas de la Universidad Federal de Paraná en un período de 5 meses para los chequeos de rutina. Los participantes del grupo control fueron elegidos entre los niños y adolescentes registrados en la Clínica de Odontología de la Universidad Federal de Paraná.

Los criterios de inclusión fueron la presencia de la salud gingival, tanto de los dientes primarios como de los permanentes y la ausencia de uso de antibióticos en los últimos 3 meses. En el grupo de control, otro criterio de inclusión fue la ausencia de cualquier problema de salud sistémica conocido.

Colecta de las muestras

La colecta de la placa supragingival se realizó con una cureta periodontal McCall sobre las superficies vestibulares y linguales de todos los dientes.

Las muestras recogidas se colocaron en tubos de 1,5ml que contenían 50 ml de tampón (50 mM de Tris-HCl, pH 7,6; EDTA 1 mM, pH 8 y 0,9% de NaCl). Todos los tubos fueron etiquetados con el código de cada paciente. Todas las muestras fueron almacenadas en una nevera a -20ºC. Todas las análisis fueron realizadas en un período entre 7 y 10 días después de la colecta.

Extracción de ADN

Las muestras de placa dental fueron descongeladas y centrifugadas a 10.000xg durante 5 min en una microcentrífuga a 4°C. El sobrenadante se desecho y el precipitado resultante se lavó dos veces más con 1 ml de agua estéril. El precipitado se reconstituyó con 0,5 ml de agua estéril, y se incubó a 55ºC durante 120 min. Las muestras se centrifugaron otra vez, a 10.000xg durante 10 min a 4ºC y el sobrenadante se utilizó para el análisis de PCR.

Protocolo de PCR

La concentración de ADN se midió utilizando el espectrofotómetro Nanodrop (Nanodrop Technologies, DE, EE.UU). Los iniciadores específicos de las especies utilizadas para realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de este estudio se encuentran en la Tabla 1. Las secuencias de los cebadores fue seleccionada con base en el trabajos anteriores13,14,15. Los ácidos nucleicos fueron extraídos de las cepas ATCC de cada una de las bacterias y se amplificó el gen 16S rRNA. El medio de reacción para la amplificación de PCR contenía 100ng de ADN, 10pmol de cada cebador y 10µl del tampón de reacción 2X verde GoTaq® (pH 8,5) (GoTaq® ADN polimerasa, 400 µM de dATP, 400 µM de dGTP, 400 µM de dCTP, 400 µM de dTTP y 3 mM MgCl2). Los ADN aislados de A. actinomycetemcomitans ATCC 29522, P. gingivalis ATCC 33277, F. nucleatum ATCC 25586 y T. denticola ATCC 33520 fueron probados con los cebadores especie-específicos como controles positivos. Se utilizó agua destilada estéril como control negativo para cada serie de reacciones.

La amplificación por PCR se llevó a cabo en un termociclador programable (Mastercycler Gradient, Eppendorf, Alemania) utilizando el programa listado en la Tabla 1. Después de la amplificación, 10µl de cada producto de PCR fue analizado por medio de electroforesis en un gel de agarosa al 2%. El gel fue teñido con 0,03g/ ml de bromuro de etidio para la visualización (Figura 1). La abundancia relativa de cada producto de PCR se determinó mediante análisis cuantitativo de las fotografías digitales de los geles utilizando el software Labworks 4.5 (UVP Products, Upland, CA). Una escala de 100-pb (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) se usó como patrón de peso molecular

Tabla 1. Cebadores y condiciones para la identificación de los microorganismos.
Tabla 1. Cebadores y condiciones para la identificación de los microorganismos.

Análisis estadístico

Los test ANOVA, chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher fueron utilizados para determinar la asociación las variables y los diferentes grupos, escogiendo un nivel de significancia de 95%.

Resultados

Un total de 34 niños y adolescentes participaron del estudio. El grupo AF se dividió en dos subgrupos: Pre-trasplante (n = 13) y Post-trasplante (n = 8). El grupo control tuvo 13 participantes. Datos demográficos de todos los grupos se presentan en la Tabla 2. Cuando se compararon los parámetros demográficos, no se observó ninguna diferencia estadísticamente entre los grupos.

Los cebadores para A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, F. nucleatum, y T. denticola demostraron amplificación específica de cada especie bacteriana y no amplificaron el ADN de otras especies, validando así su especificidad.

Perfil de migracion eletroforética de los fragmentos de PCR amplificados con los cebadores de los diferentes microorganismos en la placa supragingival.
Figura 1. Perfil de migracion eletroforética de los fragmentos de PCR amplificados con los cebadores de los diferentes microorganismos en la placa supragingival. Electroforesis en el gel de agarosa 1,5%.
  1. Marcador de peso molecular de 100pb (INVITROGEN)
  2. ADN de A. actinomycetemcomitans (557pb).
  3. Muestra de ADN extraído de la placa supragingival amplificada con cebadores de A. actinomycetemcomitans (557pb).
  4. ADN de P. gingivalis (404pb).
  5. Muestra de ADN extraído de la placa supragingival amplificada con cebadores de P. gingivalis (404pb).
  6. ADN de T. denticola (316pb).
  7. Muestra de ADN extraído de la placa supragingival amplificada con cebadores de T. denticola (316pb).
  8. ADN de F. nucleatum (360pb).
  9. Muestra de ADN extraído de la placa supragingival amplificada con cebadores de F. nucleatum (360pb).
  10. Muestra amplificada con cebador control.

El A. actinomycetemcomytans sólo fue encontrado en una muestra del grupo pre-trasplante.

Tabla 2. Datos demográficos de la población estudiada.
Tabla 2. Datos demográficos de la población estudiada.
1 Salarios mínimos de Brasil. Un salario equivalente a U$300.

El microorganismo P. gingivalis se identificó en una muestra del grupo pre-trasplante y en una del grupo post-trasplante. El T. denticola se encontró únicamente en dos muestras del grupo pre-trasplante. El microorganismo F. nucleatum se observó en todos los grupos. La presencia de los microorganismos varió del 30% en el grupo control al 58% en el grupo Pré-trasplante. No fueron encontradas diferencias estadísticas entre los grupos. La distribución de los microorganismos por grupo se presenta en la Tabla 3.

Tabla 3. Prevalencia y distribución de las bacterias investigadas en cada grupo.
Tabla 3. Prevalencia y distribución de las bacterias investigadas en cada grupo.

Discusión

Este es el primer estudio que evalúa la prevalencia de microrganismos periodontopatógenos en niños con anemia de Fanconi antes y después del transplante, en la placa dental. Por este motivo, las bacterias incluidas en este trabajo son de aquellas consideradas más relevantes por la literatura científica16,17.

Uno de los principales aspectos de prevención de enfermedades periodontales es la identificación de los individuos con alto riesgo. La presencia de patógenos es uno de los indicadores más importantes periodontales18 y como las personas con anemia de Fanconi son susceptibles a infecciones el propósito de este estudio fue detectar cuatro bacterias asociadas con la enfermedad periodontal en esta población.

La frecuencia de los microorganismos periodontales en la placa supragingival de los grupos pre-trasplante, post-trasplante y control fueron 62%, 38% y 30%, respectivamente. En un único individuo del grupo pre-trasplante se observó la presencia de los cuatro microorganismos analizados. En el grupo post-trasplante se observó la presencia de P. gingivalis y F. nucleatum y en el grupo control sólo se observó F. nucleatum.

La ausencia del P. gingivalis en el grupo control y del T. denticola en los grupos post-trasplante y control fue similar a la observada por Kimura et al.12 en 144 niños sanos de entre dos y 13 años de edad. Por otra parte, Nowzari et al.3 observaron la presencia de A. actinomycetemcomitans y F. nucleatum en la placa dental de un paciente de 11 años de edad con AF y periodontitis agresiva. Sin embargo, el T. denticola y el P. gingivalis no fueron analizados.

La presencia de A. actinomycetemcomitans también se ha observado con frecuencia en pacientes jóvenes con periodontitis agresiva19, en los pacientes después de un trasplante de médula ósea7, en sujetos jóvenes sistémicamente sanos12 y los jóvenes con y sin gingivitis20 . La presencia de microorganismos en diferentes situaciones clínicas y sistémicas confirma la teoría de la caja de la tarjeta ecológico en el que sólo la presencia del microorganismo no es suficiente para el desarrollo de la enfermedad21.

Pattni et al.7 encontraron una alta prevalencia de P. gingivalis en sujetos con leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, el mieloma, mielodisplasia y linfoma no Hodgkin, todos antes del trasplante de médula ósea. Tres meses después del trasplante hubo una reducción del 12% al 5% y seis meses después no se detectó la presencia de P. gingivalis en los mismos individuos. La justifi de la reducción de la P. gingivalis fue el uso de la terapia con medicamentos antibióticos. En el presente estudio la terapia con antibióticos no se puede considerar como un factor de reducción de la frecuencia de los microorganismos en la placa dental, ya que los individuos en los que no se detectaron los microorganismos investigados no utilizaban antibióticos en el momento del estudio.

Por otro lado, el grupo pre-trasplante puede haber mostrado una frecuencia más alta de los microorganismos en la placa supragingival debido al régimen de acondicionamiento antes del trasplante, que promueve la pancitopenia, resultando en la vulnerabilidad a las infecciones virales, fúngicas y bacterianas22.

Entre los microorganismos estudiados el F. nucleatum fue el que apareció con más frecuencia. Estos resultados pueden explicarse por el hecho de que F. nucleatum es un colonizador primario y coagregador de los microorganismos en la placa dental, por lo tanto, los otros microorganismos se adhieren a la placa a través de enlaces con el F. nucleatum y requieren un tiempo más largo para la colonización23,24. Por otra parte, la baja frecuencia de los microorganismos de la película supragingival en este estudio también puede haber sido por la dificultrad de estandarizar el tiempo entre la última vez que los participantes cepillaron los dientes y la colecta de la placa. Por ejemplo, microorganismos como el A. actinomycetencomitans necesitan de seis horas para comenzar a aparecer en la placa y con niveles extremadamente bajos25.

Lyko et al.26 evaluaron la presencia y distribución de los mismos 4 microorganismos en la saliva de niños con anemia de Fanconi. Los resultados mostraron que no hay diferencia entre la presencia de los microorganismos y las combinaciones entre ellos. Esto sugiere que las condiciones sistémicas de los individuos con anemia de Fanconi no interfieren con la presencia de estas bacterias en la saliva.

Conclusión

Los resultados del estudio sugieren que las alteraciones sistémicas encontradas en los individuos con AF no afectan la distribución de las cuatro bacterias analizadas. Los métodos de detección de PCR y placa dental proporcionan un método rápido y preciso para la detección de la presencia de patógenos periodontales en la cavidad oral esta población y se necesitan más estudios comparando la presencia de estas especies en la placa dental y el desarrollo de la enfermedad periodontal en pacientes con AF.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la Coordinación de Perfeccionamiento del Personal de Nivel Su- perior (CAPES).

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Recibido: 02-05-2014
Aceptado: 16-05-2014
Correspondencia: Prof. Dr. José M. Amenábar, Departamento de Estomatología Universidad Federal de Paraná, Brasil. Av. Lothário Meissner 632, Jardim Botanico. Curitiba-Paraná-Brasil. CEP: 80210-170. Teléfono: +55-41-3360-4024. Fax: +55-41-3360-4053. Email: jamenaba@ufpr.br